Biologia AR Szczecin

o to konspekty z ostatnich cwiczen i jeszcze innych , one obowiazuja tych co beda dopytywani i co chca ewentualnie cos poprawic



Kultury in vitro zwierząt

Ćwiczenie 7
Zmiana płynu hodowlanego w hodowli typu monolayer.

Częstość zmiany pożywki jest uzależniona od gęstości komórek w hodowli, tempa ich proliferacji i metabolizmu. Kiedy zaczyna brakować składników odżywczych lub zostanie nagromadzonych zbyt duża ilość produktów metabolizmu w medium, komórki reagują w pierwszej fazie zatrzymując podziały komórkowe, a później zmienia się morfologia komórek. W cytoplazmie zaczynają pojawiać się ziarnistości, a cytoplazma ulega wakuolizacji. W ostatniej fazie  komórki przybierają okrągły kształt i odrywają się od podłoża. Bardzo ważne jest to jak produkty metabolizmu komórkowego wpływają na zmiany pH pożywki, a to z ko-lei wpływa na kondycję komórek w układzie in vitro. Optymalnym zakresem dla większości komórek jest pH pomiędzy 7,0 a 7,4. Przy pierwszych objawach niekorzystnych warunków hodowlanych należy zmienić medium, a jeżeli hodowla jest zagęszczona, przepasażowac ją.  Optymalna objętość medium w naczyniu wynosi od 0,2 do 0,5 ml/cm2. Większa ilość może ograniczać dostępność tlenu.
Czasem wymienia się tylko część pożywki na świeżą, i pozostawia się część zużytej. Taką mieszaninę nazywamy „conditioned medium”. Stosuje się ją w hodowlach, które wy-prowadza się z inoculum o małej gęstości, w sytuacji gdy komórki nie są w stanie same wy-produkować dostatecznej ilości czynników adhezyjnych i innych substancji koniecznych do stworzenia optymalnego, swoistego mikrośrodowiska hodowli.   
Oprócz dostarczenia składników odżywczych i eliminacji z pożywki produktów meta-bolizmu komórek, zmiana płynu hodowlanego umożliwia usunięcie komórek, które nie zinte-growały się z podłożem. 

Zmiana płynu.

1.    Przygotować sterylną pożywkę dodając do niej wszystkie niezbędne elementy, to jest:
-    5 ml RPMI
-    1,2 ml surowicy płodowej
-    0,12 ml roztworu antybiotyku
-    0,06 ml amfoterycyny
-    0,05 ml L-glutaminy.
2.    Odciągnąć zużyte medium za pomocą sterylnej pipety lub pompki wodnej.
3.    Przed otwarciem przygotowanego medium należy naczynie przetrzeć 70% etanolem.
4.    Nalać pożądaną ilość świeżej pożywki do naczynia hodowlanego.
5.    Umieścić hodowlę w cieplarce (37 OC, 5% CO2).




Hodowle tkankowe in vitro zwierząt

Ćwiczenie 6
Hodowle stałe.
Założenie hodowli fibroblastów.

    Pierwsze próby hodowli komórek podejmowano z wykorzystaniem izolowanych ko-mórek pochodzących z nerki i jąder małp, bądź komórek izolowanych z zarodków kurzych. Problemem jednak było to, że uzyskiwano z nich tylko hodowle pierwotne, które nie dawały się pasażować, w związku z tym niemożliwe było wyprowadzenie linii komórkowej.
    Narządem najczęściej stosowanym do zakładania hodowli są nerki. Jedną z najważ-niejszych cech komórek pochodzących z tego narządu jest fakt, że zachowują one prawidłowy wygląd, dobrze rosną i proliferują. Szybko jednak tracą, bo w czasie krótszym niż 1 genera-cja, większość ze swoich swiostonarządowych funkcji. Zjawisko to zachodzi nawet wtedy, gdy komórki te na płytce Petriego układają się w grupy przypominające kanaliki nerkowe.
Hodowle pierwotne zakładane są z materiału pobranego bezpośrednio z organizmu. Hodowle pierwotne można wyprowadzić z uzyskanych mechanicznie drobnych fragmentów, tzw. eksplantatów, świeżo wyciętych kawałków tkanki bądź narządu lub z zawiesiny komórek powstałej po ich rozproszeniu działaniem enzymów. W pierwszym przypadku komórki wyra-stają lub migrują z wycinków osadzonych na dnie naczynia hodowlanego, tworząc wokół nich jednowarstwową płytkę. Płytki wyrosłe z większej ilości wycinków mogą łączyć się i pokryć dno naczynia jedną warstwą komórek. Dzisiaj stosuje się tę technikę wówczas, gdy dysponuje się bardzo małą ilością tkanki (np. materiał biopsyjny) lub komórkami trudno adaptującymi się, np. komórki kości. W drugim przypadku hodowlę pierwotną zakłada się z zawiesiny ko-mórkowej lub komórek zagregowanych w małe grupy. Komórki po przyczepieniu do dna naczynia tworzą najpierw różnej wielkości kolonie, które proliferując powiększają się i two-rzą jedną warstwę.
Wzrost komórek w prowadzonych hodowlach określa się na podstawie tzw. krzywych wzrostu. Wzrost komórek jest obserwowany przez czas przynajmniej 10 dni, przy czym każ-dego dnia zlicza się  rosnące komórki. Wzrost komórek można podzielić na 3 fazy.

1.    Faza lag – rozpoczyna się bezpośrednio po wysianiu komórek. Czas ten jest okresem ad-aptacji komórek, które po działaniu trypsyny przy zakładaniu hodowli, odbudowują ele-menty warstwy pokrywającej od zewnątrz błonę komórkową, złożonej głównie z łańcu-chów oligo- lub polisacharydowych. W tym czasie komórki przyczepiają się do podłoża i rozpłaszczają na dnie naczynia. Ilość komórek w tej fazie na ogół nie zmienia się, ale cza-sem zdarza się, że może ona maleć na skutek obumierania uszkodzonych komórek, które nie przyczepione do podłoża obumierają. Komórki w tym okresie wchodzą w fazę G1, w tym czasie wzrasta też ilość polimeraz DNA. Dla różnych komórek faz lag ma różną dłu-gość.
2.    Faza log zw. fazą logarytmicznego wzrostu – okres intensywnego wzrostu liczby komó-rek. Komórki dzielą się w tym czasie bardzo intensywnie. Faza ta kończy się między pierwszym a drugim podwojeniem populacji komórek, osiągnięciem stanu konfluencji. Charakterystycznymi cechami komórek w tej fazie wzrostu jest ich duża żywotność i wy-sokie tempo metabolizmu. Długość tej fazy zależy od gęstości wyjściowej hodowli.
3.    Faza stacjonarna zw. plateau – czas, w którym komórki osiągają konfluencję i ustają ich podziały, a więc dochodzi do zahamowania kontaktowego wzrostu. Pewna ilość komórek umiera, sporadycznie obserwuje się podziały komórkowe. Hodowla taka charakteryzuje się szybkim wykorzystaniem medium. Komórki po osiągnięciu stanu konfluencji należy przepasażować, by nie doprowadzić poprzez dłuższe ich utrzymanie w taki stanie do wyj-ścia z cyklu i wejścia w fazę G0. Komórki będące w fazie G0  nie dają się przepasażować i hodowla taka obumiera. Najlepszym rozwiązaniem jest pasażowanie komórek w stanie semikonfluencji, czyli przed osiągnięciem stanu konfluencji, kiedy są one jeszcze w fazie logarytmicznego wzrostu.

    Fibroblasty są komórkami o kształcie wrzecionowatym bądź gwiaździstym, tworzą długie i cienkie wypustki cytoplazmatyczne. Fibroblasty powstają z komórek tkanki mezen-chymatycznej. Formy spoczynkowe fibroblastów charakteryzują się zmniejszona ilością cyto-plazmy i nazwane są fibrocytami.

Założenie hodowli fibroblastów – modyfikacja.
Przygotowanie roztworów:

1.    Roztwór trypsyny – gotowy do użycia po rozmrożeniu.

2.    Płyn Hanksa z jonami wapnia i magnezu:
-    12 ml płynu Hanksa
-    0,30 ml roztworu antybiotyków

3.    Płyn Hanksa bez jonów wapnia i magnezu:
-    8 ml płynu Hanksa
-    0,2 ml roztworu antybiotyków

4.    Płyn hodowlany:
-    5 ml RPMI
-    1,2 ml surowicy płodowej
-    0,12 ml roztworu antybiotyków
-    0,06 ml amfoterycyny
-    0,05 ml L-glutaminy ewentualnie RPMI z glutaminą

5.    Płyn jałowiący:
-    8 ml płynu Hanksa bez jonów wapnia i magnezu
-    0,8 ml surowicy płodowej
-    0,2 ml roztworu antybiotyków
-    0,1 ml amfoterycyny.


Przygotowanie tkanki:

1.    Wypreparować nerki.
2.    Przepłukać płynem Hanksa bez jonów wapnia i magnezu (roztwór 3).
3.    Rozdrobnić  wypreparowane nerki nożyczkami na szalce na drobne kawałki.
4.    Ponownie przepłukać płynem Hanksa bez jonów (roztwór 3).
5.    Wypłukane tkanki przenieść do kolby i zanurzyć w płynie jałowiącym na 1 h.
6.    Tkankę przenieść do świeżej kolby, zalać 8 ml ogrzanej w łaźni wodnej trypsyny.
7.    Umieścić w łaźni wodnej na 10 min., jednocześnie wytrząsając ręcznie zawartość kolby.
8.    Po 10 minutach pierwszą zawiesinę komórek odlać przy użyciu sterylnych pipet.
9.     Tkankę ponownie zalać 8 ml trypsyny i po 10 minutach trawienia (przy stałym, ręcznym wytrząsaniu) zawiesinę komórek odlać do probówek wirówkowych.
10.     Zawiesinę zalać 1 ml płynu Hanksa z jonami (roztwór 2).
11.    Wirować przez 10 minut przy obrotach 700-900/min.
12.    Odciągnąć supernatant jałowymi pipetami. Do osadu komórkowego ponownie dodać 5 ml płynu Hanksa (roztwór 2).
13.    Przenieść zawartość probówek na filtry nylonowe (Nitex) i przesączyć do probówki.
14.    Wirować przez 10 minut przy obrotach 700-900/ min.
15.    Po ostatnim usunięciu supernatantu do szalek Petriego wlać 3-4 ml płynu hodowlanego (roztwór 4) i dodać 0,5 ml przygotowanej zawiesiny komórkowej.
16.    Wstawić hodowlę do cieplarki (37OC, 5% CO2).


Kultury tkankowe i komórkowe in vitro zwierząt

Ćwiczenie 3
Hodowle płynne – wprowadzenie.
Przygotowanie roztworu fazeoliny LF-7.
Założenie hodowli limfocytów.


1.    Hodowle z zawiesinie.

Hodowle w zawiesinie (hodowle płynne) zakłada się w naczyniach ze stałym mieszaniem (z określoną prędkością 30-100 obr./min., czyli taką, która nie uszkodzi poddanych hodowli komórek) w celu zapobieżenia opadania komórek na dno naczynia i napowietrzania hodowli. Porównując hodowle komórek rosnących w jednej warstwie i hodowli w zawiesinie, jedną z charakterystycznych cech jest redukcja powierzchni i ilości pożywki na korzyść hodowli w zawiesinie. Mimo tak korzystnych walorów, hodowla taka wykorzystywana jest w stosunku do niewielkiej ilość komórek przejawiających zdolność do wzrostu w zawiesinie. Komórkami hodowanymi w ten sposób są limfocyty T, chondrocyty oraz niektóre linie komórek białaczkowych lub odpowiednio wyselekcjonowanych komórek nowotworowych, jak na przykład spontanicznie stransformowanej linii komórkowej HeLa. W przypadku hodowli w zawiesinie pożywki tu stosowane często wymagają modyfikacji, np. obniżenia zawartości jonów wapnia w celu uniknięcia tworzenia się agregatów i przyklejania komórek do ścian naczynia. Wydajność hodowli w zawiesinie definiowana jest  jako liczba komórek możliwych do uzyskania przy użyciu określonej objętości pożywki i jest znacznie większa, niż w przypadku hodowli jednowarstwowej.

2.    Hodowla limfocytów.

Hodowla limfocytów jest szczególnym rodzajem hodowli. Komórki w niej hodowane słabo przylegają do podłoża i dlatego przeważnie hoduje się je w niewielkich buteleczkach, w których gromadzą się na dnie, ale nie ulegają rozpłaszczeniu na nim. Wzrost limfocytów możliwy jest dzięki substancjom o charakterze lektyn, które pobudzają przekształcenie się limfocytów w komórki blastyczne, a następnie ich podziały mitotyczne. Lektyny są białkami lub glikoproteinami wybiórczo wiążącymi w sposób nieezymatyczny węglowodany glikoprotein i glikolipidów powierzchniowych komórek. Wzrost komórek możliwy jest właśnie dzięki lektynom, które działają pobudzająco na przekształcanie się limfocytów w komórki blastyczne, a następnie ich podział. Pobudzenie limfocytów T przez mitogeny wzmagają na ogół, tak zwane komórki dodatkowe. Prezentują one w pewien sposób mitogeny limfocytom T, a także dostarczają im zarazem innych dodatkowych sygnałów, np. IL-1, IL-6.
Jedną z lektyn jest fazeolina inaczej fitohemaglutynina. Jest ona białkiem wyodrębnionym z nasion strączkowych fasoli (Phaseolus vulgaris). Białko to po oczyszczeniu składa się z dwóch frakcji PHA-P (protein rich) i PHA-M (mucoprotein rich). Wywołują one aglutynacje erytrocytów u niektórych gatunków zwierząt (poprzez wiązanie fragmentów polisacharydowych błon komórek z aktywnym centrum lektyny), a formie rozpuszczalnej są silnym mitogenem limfocytów T. Działanie tego mitogenu wywołuje transformacje blastyczną. Polega ona na aktywacji małych (spoczynkowych) limfocytów, co objawia się przejściem komórki z fazy G0 w fazę G1. Komórki podlegają transformacji morfologicznej – zwiększają swoje rozmiary i jądra, następuje uwidocznienie jąderek. Następnie obserwowana jest synteza RNA i początek syntezy DNA. Komórki stają się zdolne do podziałów. Transformacja blastyczna zachodzi poprzez zdolność wiązania fazeoliny przez receptor TCR limfocytów T. Innymi mitogenami limfocytów T są konkanawalina A (Con A), kandydyna, mitogen szkarłatki amerykańskiej (PWM), ester forbolu (PMA).
Znane są tez mitogeny indukujące transformacje  limfocytów B, wśród nich występują mitogen szkarłatki amerykańskiej (mitogen nieswoisty antygenowo), lipopolisacharydy (LPS), surowica antyimmunoglobulinowa.
Fitohemaglutynina jest również określana jako induktor interferonu. Obok PHA znanymi induktorami mogą być wirusy, bakterie gram ujemne, pierwotniaki.
Stymulując limfocyty mitogenami można łatwo uzyskać dużą liczbę dzielących się komórek, co może być wykorzystywane w różnych badaniach. Jednym z takich badań jest rutynowa ocena kariotypu do czego wykorzystuje się limfocyty krwi obwodowej (prenatalne badania wykonuje się na amniocytach lub komórkach trofoblastu) co jest szczególnie przydatne w diagnostyce cytogenetycznej przy ustalaniu aberracji chromosomowych. A także oznaczenie uszkodzeń DNA metodą kometkową – metoda ta polega na elektroforezie żelowej pojedynczych komórek i oznaczaniu ilości DNA w „ogonie kometki”. Stosując odpowiednie enzymy, można nią również oznaczyć określone uszkodzenia zasad azotowych DNA, np. uszkodzenia oksydacyjne. Hodowle limfocytów wykorzystywane są również przy określaniu zgodności tkankowej pomiędzy osobnikami tego samego gatunku i wykrywaniu uczuleń chorych na rozmaite antygeny.

1. Założenie hodowli limfocytów izolowanych z wykorzystaniem Biocoll’u:

Izolacja limfocytów:

1. Do probówki wlewany 7 ml Biocoll’u.
2. Mieszamy równe objętości krwi pełnej i medium hodowlanego, a następnie przenosimy na Biocoll.
3. Wirujemy  1200 g przez 20 min.
4. Zbieramy warstwę zawierającą limfocyty (warstwa pomiędzy) i płuczemy w medium hodowlanym.
5. Wirujemy  10 min/300g.
6. 10 min/200g.


2. Założenie hodowli limfocytów z krwi pełnej:


Przygotowanie roztwory fazeoliny LF-7:

Do naczynia hodowlanego przenieść zawartość ampułki (LF-7).
Rozpuścić w 1 ml sterylnej wody destylowanej.
Dodać 6 ml płynu Hanksa.

Przygotowanie płynu hodowlanego i założenie hodowli płynnej:


Do każdego naczynia hodowlanego dodać:
-    4 ml medium RPMI 1640
-    1 ml surowicy płodowej FSC
-    0,15 ml roztworu fazeoliny
-    0,1 ml mieszaniny antybiotyków penicylina-streptomycyna
-    0,5 ml pełnej krwi

Zamknąć naczynia hodowlane parafilmem lekko opalonym nad palnikiem.
Wstawić naczynia hodowlane do cieplarki – 39 st. C.

Tempo wzrostu komórek może być różne. Często pierwsze sygnały wzrostu są widoczne po kilkudziesięciu godzinach, jednak najczęściej wzrost widoczny jest dopiero po kilku dniach (48, 72 bądź 96h).