Biologia AR Szczecin

Apoptoza i nekroza to dwa rodzaje śmierci komórki różniące się na poziomie molekularnym,biochemicznym i morfologicznym. O apoptozie mówi się,że jest to szczególny sposób aktywnej ,programowanej,altruistycznej śmierdci komórki.Natomiast klasyczne pojęcie nekrozy odnosi się do przypadkowej, patologicznej śmierci martwiczej, która jest katabolicznym, degeneracyjunym procesem.Obecnie termin ,,programowana śmierć komórki" określa każdy rodzaj śmierci komórkowej, zachodzącej zgodnie z ,,wewnątrzkomórkowym programem śmierci", niezależnie od czynnika który śmierć wywołuje. Końcowym efektem ,,programowanej śmierci na poziomie morfologicznym może być apoptoza, nekroza ( necrotic-like cell death) lub śmierć wykazująca morfologiczne cechy obu rodzajów śmierci.
Śmierć komórkową mogą indukowac czynniki biologiczne, chemiczne i fizyczne. O tym czy komórka uruchomi program apoptozy czy ulegnie śmierci nekrotycznej, decyduje rodzaj i  natężenie czynnika indukującego śmierć, okres trwania ekspozycji komórek na działanie tego czynnika oraz rodzaj komórek stymulowanych do śmierci. Ten sam czynnik może indukowac śmierć apoptyczną i/lub nekrotyczna komórki.
            Charkaterystycznymi cechami śmierci apoptycznej jest zmiana wilekości i kształtu komórki. Komórka taka zmniejsza swoja objętość, następuje kondensacja i brzeżne ułożenie chromatyny w jądrze, zachodzi kondensacja cytoplazmyi uwypuklaNIE SIE POWIERZCHNI komórki. W czasie apotozy organelle i błona cytoplazmatyczna zachowują integralnośc przez dłuższy okres. W późniejszym etapie śmier5ci apoptycznej, w wyniku dalszej kondensacji i fragmentacji jądra komórkowego oraz cytoplazmy, tworza si,ę ciałka apoptotyczne. Komórki apoptotyczne i ciałka apoptotyczne ulegaja w organizmie fagocytozie.
             Prowadzone liczne badania nad cyklem komórkowym i śmiercią komórki doprowadził do wyróżnienia kilku rodzajów śmierci apoptotycznej a mianowicie ,interfazowa śmierć komórki ( interphase cell death)  i reprodukcyjna lub mitotyczną śmierc komórki ( reproductive or mitotic cell death). Interfazowa śmierc komórki zachodzi przed jej podziałem , a mitotyczna jest obserwowana w czasie cyklu  komórkowego nastepującego  po mitozie, w czasie którego komórki były poddane działaniu czynnika cytotoksycznego.
             W odróżnieniu od apoptozy, nekroza charakteryzuje się zwiększeniem rozmiarów komórki, obrzękiem organelli komórkowych zwłaszcza mitochondriów i siateczki śródplazmatycznej. Obserwuje się poxą degradanję DNA i pyknotyczne jądra. Organelle komórkowe ulegają degeneracji, tworzą się wakuole, a polisomy odłączają się od siateczki  śródplazmatycznej. W dalszym etapie nekrozy obserwuje się dekstrukcje chromatyny, zanik jądra i w końcu całkowitą dezintegracje komórki.
            Komórki i tkanki hodowane in vitro wymagają odpowiednich warunków: właściwego składu pożywki wzbogaconej o odpowiednie substancje odżywcze i antybiotyki, określonego inoculum komórkowego przy zakładaniu  hodowli, stałego poziomu CO2, stałej temperatury. Spełnienie tych warunków gwarantuje nieprzekraczająca 5% ilość komórek apoptotycznych i nekrotycznych w hodowli. Utrata składników odżywczych,zmiany fizyko-chemiczne mogą być przyczyną zwiększonej liczby komórek ulegających śmierci ulegających śmierci w hodowli kontrolowanej.

             Jedna z podstawowych cech umozliwiających rozróżnienie komórek martwych i życiowych jest utrata funkcji transportowych i przerwanie strukturalnej integralności  błony komórkowej. Zmiany właściwości błony związane sa ze zdolnością komórek do przeżycia. Niezmieniona strukturalnie i właściwie funkcjonująca błona normalnych, żywych komórek i błona komórek wczesnoapoptotycznych mają zdolność wydalania dodatnio naładowanych cząsteczek barwników, takich jak błekit tryptanu, jodek propidyny, jodek etydyny. Komórki późnoapoptotyczne i komórki nekrotyczne w różnym stopniu wybarwiają sie tymi barwnikami.

            Barwienie komórek błękitem trypanu stanowi rutynowż metodę,szeroko stosowaną w laboratoriach, w hodowlach komórkowych zarówno kontrolnych, jak i doświadczalnych, pozwalającą na określenie procentowej ilości komórek póżnoapoptotycznych i nekrotycznych.

            Błękit trypanu (trypan blue C34H24N6Na4O14S4) jest barwnikiem dwazowym (znane jest działanie trypanu blue jako destabilizatora błon lizosomalny ( powoduje zwiększenie przepuszczalności błon lizosomalnych, co wpływa na wzrost aktywności hydrolaz lizosomalnych).Trypan blue powoduje przyspieszony wzrost komórek nowotworowych (melanoma),powoduje zmiany ultrastrukturalne, nieregularny kształt jąder komórkowych, rozproszenie chromatyny oraz wzrost liczby struktur Golgiego. wykazano również że barwnik ten w komórkach barwnych nabłonka siatkówki może działać supresyjnie, na żywotność komórki.Moależy że on powodować redukcję żywotności komórki i zmianę w ekspresji genów związanych z apoptozą i zatrzymaniem cylku komórkowego ( między innymi zwiększenie ekspresji p53 i p21 )Wykazano również działanie trypanu na katepsyne D i białka G.

Badanie żywotności komórek metodą błękitu trypanu.

Wykonanie badania:
1. Kroplę zawiesiny komórek pochodzących z hodowli  limfocytów należy zmieszać na szkiełku podstawowym z kroplą błękitu trypanu  ( 0,4% w PBS) w stosunku 1:1. Należy unikać kontaktu barwnika ze skórą ze względu na jego rakotwórcze działanie!

2. Płyn należy nakryć szkiełkiem przykrywkowym i odczekać 3 minuty. Za względu na obserwowane zmiany w wybarwieniu komórek  , analize należy rozpoczynać dokładnie po upływie 3 minut po zmieszaniu zawiesiny komórkowej z roztworem błękitu trypanu.

3.Należy policzyć całkowitą ilość komórek i osobno ilość komórek zabarwionych. Komórki martwe poznaje się po niebieskim zabarwieniu jąder.

4.Należy obliczyć procent nie zabarwionych żywych komórek.

                           Należy pamiętać,że błękit trypanu po dłuższej inkubacji jest dla komórek toksyczny. Jego działaniecytotoksyczne mozna stwierdzić podczas ponownej obserwacji preparatów po około 30 minutowej inkubacji. Ilośc komórek wybarwionych powinna wzrosnąć.