Biologia AR Szczecin

HODOWLA ZARODKÓW PTAKÓW IN VITRO

Przyczyną mniejszego zainteresowania metodami biotechnologii w odniesieniu do ptaków jest możliwość uzyskania znacznie szybszego niż u ssaków, postępu genetycznego w liniach ptaków selekcjonowanych metodami genetyki populacji.
Sprzyja temu:
•    uzyskanie dużej liczby potomstwa zarówno po ojcu jak i od jednej matki  oraz szybka wymiana pokoleń.
•    Różnorodność ras, a zwłaszcza wyspecjalizowanych homozygotycznych linii ptaków umożliwia także szerokie wykorzystanie w ich hodowli zjawiska heterozji.
Ponadto specyficzny cykl rozwojowy ptaków sprawił, że manipulacje z gametami (oocytami), lub zarodkiem w stadium jednej komórki, ich przechowywanie oraz mikroinjekcja materiału genetycznego (DNA) do jądra komórki są utrudnione lub były do niedawna niemożliwe.

Opracowanie metod zapłodnienia i hodowli in vitro oocytów i zarodków ssaków umożliwiło ogromny postęp w badaniach fizjologicznych i biochemicznych mechanizmów oogenezy, zapłodnienia i rozwoju zarodkowego tej grupy zwierząt. W ostatnich dziesięciu latach metody te nabrały także wielkiego znaczenia w związku z otwierającymi się możliwościami otrzymywania organizmów transgenicznych.



Pomimo, iż hodowla zarodków ptaków poza jajem, umożliwiająca ich szczegółową obserwację budziła zainteresowanie badaczy od dawna, to rozwój odpowiednich metod postępował ze znacznym opóźnieniem w stosunku do ssaków.

Przyczyny:
•    trudności w manipulacji dużymi oocytami ptaków, zawierającymi znaczne ilości żółtka
•     trudności związane z otrzymaniem oocytów (zapłodnione jajo w momencie zniesienia zawiera zaawansowany w rozwoju zarodek). Tak więc pozyskanie oocytu lub zarodka z jajowodu wymaga najczęściej uśmiercenia samicy.

ETAPY ROZRODU PTAKÓW

oogenezę ® dojrzewanie oocytu ® owulację ® zapłodnienie ® rozwój zarodka ® wyklucie (narodziny) nowego osobnika.

U ssaków możliwe jest już przeprowadzenie tych kolejnych etapów in vitro nie tylko dla każdego etapu oddzielnie, ale także w jednym cyklu tzn. poczynając od oocytu znajdującego się jeszcze w pęcherzyku jajnikowym, poprzez dojrzewanie, zapłodnienie i wczesny rozwój zarodka.
Późniejszy, postimplantacyjny rozwój ssaka musi, jak dotąd odbywać się in vivo w organizmie matki.

Krótkoterminowa hodowla blastodermalnego zarodka ptaka była znana od dawna. Polegała ona na wycięciu tarczki zarodkowej z zapłodnionego jaja, wraz z kawałkiem błony żółtkowej, która służyła jako podstawa dla rozwijającego się zarodka, umieszczenia jej na odpowiedniej pożywce i inkubacji przez 24 do nawet 48 godz.

Najbardziej znaną i często używaną była metoda opracowana przez New (1955):
błonę żółtkową wraz z tarczką zarodkową (oczyszczoną z żółtka) nanoszono na szklany pierścień i przykrywano drugim, tak aby zapobiec marszczeniu się i fałdowaniu błony, co powodowałoby również nieprawidłowe położenie struktur rozwijającego się zarodka. Pierścienie umieszczone na szkiełku zegarkowym, na agarze, zapewniały kilkudziesiątgodzinną  inkubację zarodków, co umożliwiało szczegółowe obserwacje i manipulacje zarodkami.

METODA HODOWLI ZARODKÓW NA PIERŚCIENIACH BIBUŁOWYCH  (OLSZAŃSKA I LASSOTA, 1980)

(Lepsza do celów biochemicznych i biologii molekularnej)
Metoda ta pozwala na masową hodowlę zarodków blastodermalnych w plastikowych szalkach do hodowli tkankowych.
SPOSÓB POSTĘPOWANIA:
1.    z bibuły Whatman wycinano pierścienie bibułowe o wewnętrznej średnicy od 5- 10 mm;
2.    żółtko zapłodnionego jaja umieszczano na plastikowej łyżeczce i oczyszczano dokładnie z białka jego powierzchnię nad tarczką zarodkową. Na to miejsce nakładano bibułowy pierścień tak, aby tarczka zarodkowa znalazła się w jego centrum;
3.    obcina się błonę żółtkową dookoła zewnętrznego obwodu pierścienia bibułowego i przytrzymując pincetą krawędź błony wraz z pierścieniem bibułowym ściąga się ostrożnie tarczkę zarodkową z żółtka, tak aby jej nie uszkodzić i nie przesunąć na błonie, a jednocześnie usunąć nadmiar żółtka z jej powierzchni wewnętrznej;
4.    pierścienie z tarczkami zarodkowymi układa się powierzchnią wewnętrzną do góry, a błoną żółtkową do dołu, na szalkach z rzadkim białkiem jako pożywką. Do białka, zależnie od  potrzeby, można dodawać znakowane prekursory kwasów nukleinowych, białka lub inne substancje, których metabolizm w zarodku lub wpływ na rozwój zarodka zamierzamy badać. Na jednej szalce można umieścić nawet kilkadziesiąt zarodków;
5.    otwartą szalkę z pożywką białkową i zarodkami wstawia się do innej, większej i głębszej, wyłożonej zwilżoną ligniną lub watą,  przykrywa wieczkiem tworząc jak gdyby wilgotną komorę i wstawia do inkubatora o temp. 37.5oC.

W ten sposób można hodować nie tylko zarodki wycięte z jaj blastodermalnych, ale także uzyskane z jaj jajowodowych lub nawet inkubowane już przez krótszy lub dłuższy czas in ovo.

Ponieważ hodowane w ten sposób zarodki  rozwijały się nawet przez 48 godz., przedstawione metody umożliwiają obserwację większości struktur zarodkowych, np., bicie serca, powstawanie wysepek krwiotwórczych, itd., 

Możliwa jest także długotrwała hodowla zarodków (uprzednio inkubowanych in ovo, przez 1-3 doby) wraz z całą zawartością jaja, w pojemnikach zastępczych, imitujących skorupę jaja.
Próby kultywacji embrionów w szklanych naczyniach podejmowano na przełomie XIX i XX wieku.
Przez dziesiątki lat próby te starano się, ze zmiennymi sukcesami doskonalić, używając do hodowli naczyń ceramicznych, zlewek laboratoryjnych, skorup plastykowych, płytek Petriego, woreczków foliowych oraz różnych kombinacji plastykowych osłon foliowych.
METODA HODOWLI ZARODKÓW KURZYCH IN VITRO W PLASTYKOWYCH, PRZEZROCZYSTYCH KONTENERACH (BEDNARCZYK, 1999)

(umożliwia obserwację rozwijających się zarodków w sposób ciągły)


SPOSÓB POSTĘPOWANIA:
1.    Sterylne kontenerki wyściela się radiacyjnie wysterylizowaną folią poliuretanową, której brzegi przykleja się do krawędzi kontenerka
2.    Wyjęte z inkubatora jaja odkaża się alkoholem, umieszcza w kontenerze i poddaje naciskowi, za pomocą specjalnego urządzenia. Nacisk powoduje pęknięcie skorupy wzdłuż części równikowej. Po usunięciu skorupy, w kontenerze pozostaje zarodek wraz z całą treścią. Należy zwracać uwagę, aby tarczka zarodkowa była przykryta białkiem – jeżeli nie jest przykrywamy ją białkiem z innego jaja
3.    Kontener przykrywamy szczelnym wieczkiem i umieszczamy w aparacie wylęgowym. Ląg prowadzi się w optymalnych warunkach temperatury i wilgotności, ale z wyłączonym mechanizmem obracania

c.d.
Wpływ na uzyskane wyniki mają:
1.    system przenoszenia zarodka z jaja do kontenera, redukujący ewentualne mikrouszkodzenia błony żółtkowej
2.    wielkość, średnica i kształt pojemnika, w którym prowadzi się hodowlę oraz jego przenikalność dla pary wodnej, tlenu i dwutlenku węgla
(optym. średn. – 7,8 cm lub zbliżona do wymiarów jaja: 6,0 x 4,5 cm)
3.    rodzaj tworzywa, z którego zbudowane są: wieczko, kontener i umieszczona w nim folia, umożliwiająca odpowiednie przenikanie wody, tlenu i dwutlenku węgla

Przeżywalność embrionów inkubowanych opisaną metodą zależy od czasu lęgu in ovo (czas poprzedzający transfer zarodków) i wieku embrionów (z upływem czasu odsetek zarodków żywych maleje).
Najlepsze wyniki (ponad 40% przeżywalności w 18 dobie lęgu) uzyskuje się wśród embrionów, których rozwój in vitro poprzedza 48-godzinny ląg in ovo.
W opisanych warunkach nie dochodzi naturalnie do wylęgu, przede wszystkim dlatego, że embriony pozbawione są dostatecznej ilości wapnia, którego podstawowym źródłem (w około 80%) jest skorupa.

Inną z przyczyn wczesnej zamieralności mogą być właściwości fizyczne treści jaja, zawierającego stosunkowo lekkie żółtko (gęstość 1,029 g/cm3) i cięższe białko (gęstość od 1,036 do 1,040 g/cm3).
Umożliwia to naturalne unoszenie się żółtka na powierzchni białka, ale równocześnie stwarza niebezpieczeństwo izolowania zarodka od białka, które w początkowych fazach rozwoju jest dla niego jedynym źródłem substancji odżywczych. Po 4 dobie lęgu naczynia krwionośne są już rozwinięte na tyle, że umożliwiają kontakt blastodermy z białkiem, ponadto wielkość owodni jest wystarczająca, aby zabezpieczyć embrion przed wysychaniem. Toteż stąd zalecenie by nakładać na kulę żółtkową, w pierwszych dobach inkubacji plastykową obrączkę, powodującą zanurzenie żółtka w białku.

Wpływ na przeżywalność zarodków kurzych podczas inkubacji in vitro ma również zmieniająca się lub stała pozycja skorup zastępczych lub pojemników je imitujących - kontenerów.

Inne (poza przeżywalnością) parametry oceny skuteczności systemów hodowli zarodków in vitro:
1.    masa ciała zarodków;
2.    stopień zaawansowania erytropoezy;
3.    aktywność tkankowa na podstawie oznaczenia receptorów insuliny w błonach komórkowych mózgu, wątroby i mięśni;
4.    porównanie poziomu hormonów płciowych (estradiolu i testosteronu).

Np.
W badaniach Bednarczyka i wsp. (1997) stwierdzono, że chociaż masa ciała zarodków kurzych, pochodzących z hodowli in vitro była w 12 dobie inkubacji istotnie mniejsza, w porównaniu z masą zarodków inkubowanych in ovo, to jednak obie grupy zarodków nie różniły się, w 14 dobie, pod względem badanych parametrów krwi oraz właściwości receptorów insuliny w badanych tkankach.
Uzyskane wyniki świadczą, że tkanki 14 embrionów hodowanych in vitro nie tracą specyficznych właściwości anabolicznych.

W przypadku hodowli, w pojemnikach imitujących skorupę jaja, zarodki wprawdzie przeżywały niekiedy do czasu wyklucia, ale były opóźnione w rozwoju, mniejsze, wykazywały brak wapnia, szereg deformacji rozwojowych: kości, układu krwionośnego, część białka pozostawała niewykorzystana, itp.

Jedną z przyczyn opóźnionego rozwoju, zwłaszcza zahamowania osteogenezy, a w konsekwencji wczesnej zamieralności zarodków inkubowanych in vitro, w systemach pozbawionych skorupy jest niedobór wapnia, którego najważniejszym źródłem dla rozwijającego się zarodka jest, jak już wspominano skorupa jaja.

HODOWLA W SKORUPACH ZASTĘPCZYCH

Znacznie lepsze wyniki, zwłaszcza w odniesieniu do przeżywalności embrionów można uzyskać dokonując transferu 72 godz. zarodków kurzych ze skorup dawczyń do większych skorup biorczyń (kurzych lub indyczych).
Rowlett i Simkiss  uzyskali 21.7% przeżywalności zarodków w 21 dobie lęgu i wyląg kilku z nich.

Zalety systemu hodowli zarodków w skorupach zastępczych:
•    dzięki naturalnemu rozwojowi błon, omocznia przylegając całą powierzchnią do skorupy zastępczej zapewnia wystarczająco dużą  powierzchnię do wymiany gazowej;
•    odpowiedni rozwój błon umożliwia transport jonów wapnia, którego podstawowym źródłem jest skorupa;
•    możliwa jest pełna resorbcja woreczka żółtkowego, stanowiącego podstawowe źródło składników energetycznych w ostatnim okresie rozwoju zarodka i wylężonego pisklęcia.
Wadą tej techniki jest fakt, że skorupa jaja nie pozwala na bezpośrednią obserwację zarodka w trakcie rozwoju.

KOMPLETNY SYSTEM HODOWLI ZARODKA (PERRY, 1988).

OD 1-KOMÓRKOWEJ ZYGOTY AŻ DO WYLĘGU
(polegający na zmianie warunków hodowli w różnych okresach inkubacji)


FAZA PIERWSZA (I) - odpowiadająca okresowi przypadającemu na rozwój jajowodowy zarodka, obejmujący około 24 godz. po zapłodnieniu.

Żółtko otoczone  kapsułą gęstego białka wyjmowano z części jajowodu zwanej  magnum i umieszczano w naczyniu szklanym z pożywką złożoną z rzadkiego białka i roztworu soli (50 mM KHCO3, 30 mM NaHCO3, 10 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.7 mM Ca Cl2 i 11 mM glukoza), w stosunku objętościowym 3:2.
Naczynie szczelnie zamykano, aby zmniejszyć dostęp powietrza i inkubowano przez 24 godz. w 41-42oC (temperatura wewnątrz jajowodu). Blastodysk w fazie I nie powinien być przykryty pożywką.

FAZA DRUGA (II) - odpowiadająca początkowemu okresowi rozwoju, w której cały zarodek musi być otoczony białkiem i przykryty pożywką, jeszcze bez wytworzenia komory powietrznej

Po 24 godz. inkubacji żółtko wraz z kapsułą białkową przenoszono do pustej skorupy jajowej, dopełniano pożywką złożoną z białka i roztworu soli (2:1 v/v) i szczelnie zamykano spożywczą folią plastikową, umożliwiającą swobodną wymianę gazów i pary wodnej.
Takie „zastępcze jaja” umocowane w specjalnych pojemnikach wstawiano do inkubatora w temp. 38oC i inkubowano przez 3 dni, zapewniając automatyczną zmianę kąta ich nachylenia co godzinę.

FAZA TRZECIA (III) – końcowa
Po 3-ch dniach rozwijające się zarodki wraz z całą zawartością skorupy (kapsuła białkowa + pożywka) są przenoszone do innych  zastępczych skorup, które powinny być znacznie większe od skorup używanych w fazie II. Najczęściej stosuje się skorupy jaj dwu-żółtkowych lub też jaj indyczych, z obciętym tępym końcem. Po umieszczeniu zawartości skorup II w większych skorupach zastępczych pozostaje pusta przestrzeń pełniąca funkcje komory powietrznej.
Otwór w skorupie jajowej zakleja się (przy pomocy białka) ponownie podwójną folią spożywczą (częściowo przepuszczalną dla gazów) i jaja wstawia do inkubatora, gdzie przez pierwsze 5 dni są inkubowane przy zmiennym kącie nachylenia.
Następnie inkubacja przebiega przy stacjonarnym pionowym ustawieniu, aż do wylęgu. Rosnące zarodki wytwarzają błonę kosmówkowo-omoczniową, która obrasta skorupę i umożliwia pobieranie z niej wapnia.

Podczas przenoszenia zarodków z systemu I do II i  III  usuwa się zarodki zamarłe.

ULEPSZENIA METODU PERRY’EGO
Przeżywalność zarodków jest znacznie większa jeśli do hodowli przeznaczano nie 1-komórkowe zygoty ale zarodki blastodermalne (zapłodnione jajo w momencie zniesienia). W tym przypadku wylęgowość zarodków przepiórki wzrasta nawet do 48%, a embrionów kury do 62.5%.

Lepsze wyniki uzyskano także przez zastosowanie gęstego białka zamiast pożywki i utrzymanie go w pH 7.2-7.4 w systemie I w przypadku zarodków przepiórki japońskiej pozbawionych kapsuły białkowej (Ono i  wsp., 1996).

Inną, bardzo pomysłową modyfikacją warunków hodowli było dodawanie do pożywki wapnia w postaci organicznej, co umożliwiło nawet przeprowadzenie całej hodowli w sztucznych pojemnikach. Jako pożywkę stosowano jest rzadkie białko z dodatkiem mleczanu wapnia (10-45 mg/zarodekl) lub sproszkowanych skorupek jajowych (10 mg/zarodek). Lepsze wyniki zapewnia dodatek wapnia, w postaci zmielonych skorup (50 % wylęgu) lub 25 mg mleczanu wapnia (80% wylęgu). Dodatek wapnia w formie chlorku ma toksyczny wpływ na zarodek już po jednym dniu hodowli.

Niektórzy autorzy podkreślają znaczenie dostarczenia tlenu (przepływ czystego tlenu w inkubatorze i porowata błona teflonowa).

Uzyskany postęp spowodował, że obecnie stosowane metody hodowli ptaków in vitro przewyższają znacznie dokonania w hodowli ssaków in vitro.

Te ostatnie prowadzi się bowiem jedynie do stadium blastocysty, natomiast dalszy rozwój ssaka może przebiegać wyłącznie in vivo po transplantacji i zagnieżdżeniu się zarodka w macicy.

TRANSGENEZA PTAKÓW

wprowadzenie funkcjonalnego materiału genetycznego
do komórek szlaku płciowego organizmu

Zwierzęta transgeniczne stwarzając unikalne możliwości badawcze, znajdują wiele aktualnych i potencjalnych zastosowań:
•    w badaniach podstawowych,
•    jako źródło organów dla ksenotransplantacji,
•    jako model w badaniach nad chorobami człowieka,
•    w produkcji białek o charakterze terapeutycznym (bioreaktory),
•    w rolnictwie, np. w celu manipulacji poziomem cech produkcyjnych,
•    w celu testowania szczepionek,
•    w celu testowania substancji toksycznych, itd.

Obecnie Istnieje wiele informacji o osiągnięciach w badaniach nad transgenicznymi ssakami. Natomiast informacje dotyczące ptaków o zmodyfikowanym geneotypie są stosunkowo nieliczne, a ich produkcja stwarza znaczące trudności metodyczne.


PODSTAWOWE METODY TWORZENIA PTAKÓW TRANSGENICZNYCH:
•    metoda bezpośrednia (mikroiniekcja genu do jądra komórki rozrodczej),
•    metoda pośrednia, za pomocą:  retrowirusów, plemników, komórek embrionalnych,
•    metoda in ovo.

MIKROINIEKCJA

cykl rozwojowy ptaków sprawia, że najczęściej stosowana w odniesieniu do ssaków metoda mikroiniekcji DNA do jednego z przedjądrzy, nie znajduje powszechnego zastosowania

Przeszkody:
•    trudna identyfikacja przedjądrza w otaczającym je żółtku - pomimo stosowania najnowocześniejszych technik mikroskopowych.
•    polispermiczne zapłodnienie - niemożność wyboru odpowiedniego przedjądrza (które utworzy zygotę), do którego miałaby nastąpić mikroiniekcja,

WPROWADZANIE INFORMACJI GENETYCZNEJ
ZA POMOCĄ WEKTORÓW WIRUSOWYCH

Szczególnie przydatne do tego celu są retrowirusy (wirusy, których genom stanowi RNA ), mające w swoim cyklu życiowym etap, w którym po infekcji komórki, ich informacja genetyczna zostaje przepisana na DNA (retranskrybowana). To DNA zostaje włączone do komórki gospodarza, gdzie ulega potem normalnej transkrypcji i translacji, produkując białka wirusowe potrzebne do dalszego namnażania się i infekcji innych komórek.
Włączenie DNA do genomu gospodarza uwarunkowane jest obecnością specjalnych sekwencji nukleotydów, obecnych na początku i na końcu wirusowego RNA.
Jeżeli więc, jakiś gen chcemy wprowadzić do genomu innej komórki, musimy go obudować takimi sekwencjami.
W Komórce zakażonej taką konstrukcją produkowane będą określone białka, między innymi białka zakodowane we wprowadzonym genie.

Pomimo niewątpliwych sukcesów poznawczych, metoda nie ma jednak perspektyw.
•    niedogodnością jest konieczność ograniczenia wprowadzanego konstruktu do zaledwie kilku pz
•     retrowirusy nie są narzędziem uniwersalnym, mogą bowiem (na szczęście dla wszystkich żywych organizmów) infekować jedynie komórki posiadające odpowiednie receptory.
•    manipulacje patogenami nie znajdują akceptacji społecznej, pomimo konstrukcji retrowirusów replikacyjnie defektywnych. Obawy te są uzasadnione, zważywszy na przypadki uaktywnienia się patogenów lub ekspresji niektórych genów komórki (protoonkogenów) w wyniku interakcji obu genomów.

PLEMNIKI JAKO WEKTORY

Wykorzystanie jako wektorów plemników, a więc komórek naturalnie przekazujących materiał genetyczny jest niezwykle atrakcyjne. Wprowadzenie tego rodzaju techniki w celu otrzymywania ptaków transgenicznych (i innych zwierząt) stanowiłoby prawdziwą rewolucję i przełom nie tylko w badaniach naukowych, lecz i w praktyce.
Pozwoliłoby wyeliminować uciążliwą procedurę i kosztowne wyposażenie laboratoryjne konieczne w innych technikach tworzenia chimer.

Plemniki wykazują skłonność do spontanicznego opłaszczania się w określonych warunkach, egzogennymi fragmentami DNA.

Drogi wprowadzania obcego DNA do plemników :

Inkubacja – wykorzystująca zdolność spontanicznego opłaszczania się plemników obcym DNA zachodzi od 10 do 60 min. w medium o temperaturze od 20, do 40oC. Koncentracja DNA wahała się od 0,4 do 2,0 mg/ml roztworu, a jego długość od 150 pz do 7 kpz
Lipofekcja – za pomocą kompleksu lipid/DNA. Wydajność procesu uzależniona jest w tym przypadku od proporcji składników kompleksu i od warunków fizycznych reakcji
Elektroporacja – włączanie DNA pod wpływem krótkich impulsów pola elektrycznego (od 18,6 do 27,4 ms). Napięcie pola elektrycznego zmieniało się w zakresie od 625 do nawet 10 kV/cm.

Wbudowywanie się, w określonych warunkach, egzogennego DNA do plemników jest obecnie dobrze udokumentowane, w oparciu o różnorodne metody badawcze.
Równocześnie jest oczywiste, że proces ten nie dotyczy wszystkich plemników, lecz w najlepszym razie ok. 25% ich populacji. Wobec tego wydawać by się mogło, że inseminacja kilkuset lub nawet kilku tysięcy samic, co w przypadku kur nie jest trudne, powinna zapewnić pozytywne wyniki.
Ponieważ jednak wyniki wielu doświadczeń na całym świecie przeczą tym założeniom, wydaje się, iż można postawić hipotezę, że plemniki opłaszczone są z biologicznego punktu widzenia dyskryminowane w wyścigu o zapłodnienie komórki jajowej. Stąd pomimo, że jest ich nawet do kilkudziesięciu procent, to zapładnia zawsze ten, który jest nie opłaszczony.

SPOSOBY WYTWARZANIA CHIMER PTAKÓW:

1.    Do blastodermy jednego zarodka wprowadza się rozproszone komórki blastodermalne (BCs) drugiego zarodka
2.    Do zarodka wprowadza się pierwotne komórki płciowe (PGCs) wyizolowane z innego zarodka
3.    Do układu krwionośnego jednego zarodka (w 2-3 dniu inkubacji) wprowadza się PGCs wyizolowane z układu krwionośnego innego zarodka

Podczas dalszego rozwoju wprowadzone komórki, jeżeli przeżyją, ulegają podziałom, mnożąc się, i zostają wbudowane do organizmu biorcy.

W przypadku pierwszej z opisanych metod komórki BCs wbudowują się do różnych tkanek.
W przypadku drugiej metody - PGCs stają się prekursorami komórek płciowych. Mamy wtedy do czynienia z bardzo interesującym zjawiskiem - osobnik chimera o fenotypie biorcy produkuje plemniki lub jaja będące nosicielami cech dawcy, tzn. produkuje zupełnie inne niż on potomstwo! Ptaki takie noszą nazwę chimer płciowych.

WŁAŚCIWOŚCI PREDYSPONUJĄCE KOMÓRKI BLASTODERMALNE DO MANIPULACJI W CELU TWORZENIA CHIMER

•    Zapłodnione jajo kurze w momencie zniesienia, a więc po upływie około 24 godz. od zapłodnieniu stanowi w rzeczywistości zarodek liczący kilkadziesiąt tysięcy BCs.

•    Komórki te tworzą tarczkę zarodkową, (blastoderma) oddzieloną od masy żółtkowej w części centralnej jamą podzarodkową, dzięki czemu blastula może być łatwo izolowana, przy użyciu krążka z bibuły, z otaczającego ją żółtka.

•     Komórki tworzące tarczkę zarodkową mogą zostać rozproszne w 0,25% roztworze trypsyny lub mechanicznie poprzez kilkukrotne pipetowanie, przy czym zdolne są, po tych zabiegach do dalszego rozwoju.

•    Komórki blastodermalne zachowują właściwości totipotentne, czyli w momencie zniesienia jaj ich funkcje nie zostały jeszcze w pełni zróżnicowane. Z drugiej strony stało się oczywiste, że wśród komórek izolowanych z tarczki zarodkowej znajdują się nie zróżnicowane morfologicznie PGCs (lub ich prekursorzy).

•    Ponadto komórki blastodermalne charakteryzuje znaczna przeżywalność w wyniku przetrzymywania in vitro (w temp. 10-15oC co najmniej tydzień ) lub nawet po zamrożeniu w ciekłym azocie.

•    Udowodniono, że do BCs, podobnie jak do innych typów komórek, możliwe jest wprowadzenie w warunkach in vitro, w wyniku lipofekcji lub elektroporacji, a więc powszechnie stosowanymi metodami, egzogennego DNA, które ulega w nich rekombinacji i ekspresji.

Najbardziej skomplikowaną czynnością jest iniekcja, przez niewielki otwór w skorupie biorcy, malutkiej kropelki zawiesiny, w której znajduje się od 100 do 1000 blastodermalnych komórek dawcy.
Aby tego dokonać, należy posiadać precyzyjne narzędzia, tj. mikromanipulator, stereomikroskop, mikropipety oraz urządzenia do ich ostrzenia i wyginania pod odpowiednim kątem. Po zabiegu otwór się zalepia (np. plastrem). Tak spreparowane jajo przeznacza się do wylęgu.

W celu łatwej, jednoznacznej i przede wszystkim możliwie jak najwcześniejszej identyfikacji chimer, jako biorcę w przypadku kur wykorzystuje się  najczęściej zarodki White leghorn, a więc rasy homozygotycznej pod względem  dominującego genu inhibitora melaniny (II), warunkującego białą barwę upierzenia ptaków.
Dawcami komórek są natomiast zarodki kur posiadające w tym locus  parę alleli recesywnych (ii), a więc warunkujących wystąpienie ciemnego upierzenia u powstajacych chimer. Są to najczęściej kury ras Barred Plymouth Rock, Rhode Island Red lub Zielononóżki kuropatwiane.

Różny genotyp biorców i dawców BC umożliwia identyfikację w dniu wylęgu ptaków posiadających charakterystyczne upierzenie. Opisane ptaki określa się jako chimery fenotypowe, w przeciwieństwie do potencjalnych chimer, a więc ptaków, których chimeryzm może dotyczyć innych (niż melanocyty) komórek.
W takim przypadku identyfikacja chimeryzmu jest trudniejsza, ale możliwa w oparciu o inne kryteria, np.:
•    w komórkach gruczołu skorupowego w oparciu o marker ciemnej barwy skorupy,
•    w erytrocytach o marker – DNA
•    w plemnikach lub oocytach o marker wylęgu piskląt rasy dawcy komórek.

Znacznie trudniejsze jest postępowanie z wykorzystaniem do tworzenia chimer pierwotnych komórek płciowych.
W organizmach dojrzałych, ale także już w zarodkach, komórki płciowe zachowują odrębność zarówno morfologiczną, jak i fizjologiczną. Dlatego komórki przeznaczone na przyszłe gamety (plemniki lub jaja) można wyodrębnić nawet w najwcześniejszych fazach rozwoju osobniczego.
W przypadku kury cechą najbardziej charakterystyczną, ułatwiającą ich identyfikację jest obecność w cytoplazmie PGCs znacznych ilości glikogenu, który w odpowiedniej reakcji przyjmuje karminowe zabarwienie.

W ostatnich latach pojawiły się lapidarne informacje o uzyskaniu zmodyfikowanych genetycznie ptaków, posiadających właściwości produkcji specyficznych białek.
Badania te zostały jednak zmonopolizowane przez wyspecjalizowane firmy komercyjne (Origen Therapeutics, Inc.; AviGenics i inne), czego efektem jest niestety brak dalszych publikacji, opisujących uzyskane wyniki.

KRAJOWE BADANIA NAD TWORZENIEM PTAKÓW BIOREAKTORÓW
Oddział Badawczy Drobiarstwa IZ wraz z Instytutem Biotechnologii i Antybiotyków PAN

Przyjęta strategia zakłada, że kury, w których genom zostanie włączony konstrukt, składający się z obcego genu umieszczonego pod kontrolą promotora ovoalbuminy, będą wytwarzały w części białkotwórczej jajowodu obce białko, które będzie wydalane wraz z jajem.
Badania zmierzały w kierunku wprowadzania egzogennego DNA do komórek blastodermalnych z zamiarem tworzenia ptaków bioreaktorów, produkujących w białku jaja kurzego białka ludzkie o charakterze terapeutycznym.
W tym celu:
1.    Skonstruowano wektory plazmidowe, wyposażone w specyficzne sekwencje regulacyjne, umożliwiające ocenę ekspresji wybranych genów w komórkach blastodermalnych kury in vitro.
2.    Jako element regulujący ekspresję obcych genów w jajowodzie wybrano promotor ovoalbuminy, podstawowego białka jaja kurzego.
3.    Do wektorów włączono geny reporterowe, np., gen lucyferazy (Luc) lub GFP (green fluorescence protein), których poziom ekspresji łatwo kontrolować  w celu optymalizacji warunków transfekcji.
W pierwszym etapie optymalizowano warunki lipofekcji, stwierdzając że ekspresja Luc uzależniona była od:
•    koncentracji komórek,
•    rodzaju stosowanego kompleksu lipidowego,
•    plazmidu DNA,
•    proporcji lipid/DNA
•    warunków fizycznych reakcji.
Obecność innych genów w komórkach i tkankach ptaków weryfikowano metodą PCR, a ich ekspresję wykorzystując gen GFP - zielonego białka fluorescencyjnego.